Hoefer HB1000 - Manual (Page 25)

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Reactivos
• Agua desionizada, estéril
• EDTA, 0,5 M
• ADN polimerasa, fragmento Klenow, 4-5 unidades/µL
• Mezcla de nucleótidos (300 mM cada uno de dATP,
dCTP, dGTP y dTTP 60 mM)
• Nonamer Random (9-mer) primers, 2,5 mg/µL en
el agua
• Tampón de reacción, 10 veces (50 mM MgCl
2
,
10 mM 2-mercaptoetanol, 500 mM Tris-HCl, pH 7,5)
• Etiquetado de nucleótidos: fluoresceína-11-dUTP
• Plantilla de ADN en agua (5 ng/mL)
Procedimiento
1. Pipetear 10 µL de ADN plantilla, más 10 µL de
agua en un tubo de microcentrífuga y se tapa
herméticamente. Asegure la tapa con una cerradura
de la tapa o utilice un clip doblado para asegurar
que la tapa no salta cuando el contenido se hierven.
2. Colocar el tubo en el baño de agua hirviendo
durante 5 minutos.
3. Colocar inmediatamente el tubo en hielo durante
5 minutos.
4. Centrifugar durante 15 segundos en microcen-
trífuga.
5. Añadir los reactivos mencionados a continuación a
un tubo nuevo en hielo en el siguiente orden:
a. 10 µL mezcla de nucleótidos
b. 5 µL Tagged nucleótido
c. 5 µL tampón de reacción (10X)
d. 5 µL cebadores aleatorios mu
e. 10 µL de ADN Boiled
f. 14 µL Agua
g. 1 µL de ADN polimerasa, fragmento Klenow
6. Mezclar suavemente y se incuba a 37 °C durante
1 hora.
7. Detener la reacción mediante la adición de 2 µL
de EDTA.
8. Sondas almacenar a -20 °C en la oscuridad.