Hoefer HB1000 - Manual (Page 24)

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4. Un tampon d’hybridation ou de déna-
turation aqueuse
Si l’hybridation a lieu dans un milieu aqueux de sel de
0,8 à 1,2 M de sel, de la T
m½
(température à laquelle
la moitié des molécules duplexes se dissocier dans un
ensemble donné de conditions) peut être de 90 °C.
Ceci est suffisant pour dégrader l’ADN, de l’ARN
et des protéines. Il peut être nécessaire d’ajouter
formamide comme un agent dénaturant abaissement/
température. Pour chaque pour cent de formamide
ajouté à la réaction de la T
m½
est réduite de 0,65 °C.
Par conséquent, au formamide 80%, les réactions
peuvent être effectuées dans les années 40-55 °C
Plage. D’autre part, la présence de formamide
nécessite de longues incubations, puisque le taux de
formamide à base d’hybridation est d’au moins trois
fois plus faible que celle de l’hybridation aqueuse.
Protocole
1
Méthode d’amorçage aléatoire de l’ADN de marquage
à la fluorescéine marqués de nucléotides ou d’autres
nucléotides marqués.
Cette méthode utilise l’ADN-polymérase à incorporer
fluorescéine-11-dUTP dans des sondes d’ADN double
brin. Ce protocole peut également être utilisée pour
incorporer des nucléotides marqués.
Équipement
• Micropipettes et cônes
• Microcentrifugeuse
• 1,5 ml microtubes
• verrouillage Cap pour microtube
• Bain d’eau bouillante
• Bain-marie réglé à 37 °C