Hoefer HB1000 - Manual (Page 23)

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2. Longitud de la sonda
El objetivo es aumentar la eficacia y reducir al mínimo
la hibridación de fondo. Cuanto mayor es la sonda,
más eficiente se une solicitado. El más pequeño de
la sonda, sin embargo, un número cada vez mayor de
las moléculas de sonda está presente por unidad de
cantidad (ng). En la mayoría de los casos las sondas
variar desde 20-1000 bps.
3. Concentración de sal y la temperatura
Hibridación de ácidos nucleicos requiere tanto de sal
(cationes monovalentes, tales como Na
+ ), para contrar-
restar los efectos de carga del esqueleto de fosfato, y
calor, para proporcionar no desnaturalizante energía
cinética que impulsa la etapa de nucleación lenta.
Debido a que los efectos de cada variable afecta a
la otra, sabiendo que la termoestabilidad del híbrido
sonda-diana es útil. La velocidad de hibridación varía
directamente con la concentración de iones de sodio
entre 0,03 y 1,2 M. La mayoría de los protocolos de
llamar para un entorno de entre 0,5 y 1,1 M de Na
+ .
Situación Respuesta
G+C = 45 – 55% Siga el protocolo normal.
G+C < 45% Bajo sal y temperatura.
G+C > 55% Elevar sal y temperatura.
Evidencia de desajuste Bajo sal y temperatura.
sonda para la diana.
Diana y la sonda se
Hibridan en una solución
degradan en un medio tampón de formamida
acuoso. basado.
Fondo de alto inaceptable. Use menos sonda.
Hibridar a un menor de sal/
temperatura más alta.
Lave con un menor de sal/
temperatura más alta.
Incubar con sal muy bajo;
cambio nucleasa (solución).
Utilice una sonda más pequeña
o una sonda diferente.
Limpiar la sonda de contami-
nantes antes de su uso.
Limpie la sonda de contami-
nantes antes de su uso.