Hoefer HB1000 - Manual (Page 20)

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Hybridisierungstechniken
Es gibt zwei wesentliche Schritte auf eine Hybri-
disierungsreaktion: 1) Hybridisierung beiden
Stränge der DNA tragenden komplementären
Sequenzen, und 2) Detektion der hybridisierten
DNA. Nahe bei der DNA-Stränge bestimmt die
Frequenz des Bindungsereignisses und daher ist
der Erfolg hängt von den DNA-Konzentrationen.
Da die Konzentration der Zielnukleinsäure in
der Regel bekannt ist, ist es ein Überschuß an
markierter Sonden-DNA, die nach vorne treibt
der Hybridisierungsreaktion. Das ist einfach
die Erhöhung der Chancen einer Sonde stößt
ein Ziel. Jedoch mit einem enormen Menge der
Sonde vorhanden sind (in Lösung oder an der
Oberfläche einer Membran) das Hintergrundsig-
nal wird auch enorm. Der typische Ansatz für
überschüssiges Hintergrund auf einer Membran
oder Folie Hybridisierung zu korrigieren ist, in
einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt waschen
wie dies begünstigt die Dissoziation von unge-
bundener Sonde von der Membran/Folie und von
nicht komplementären DNA. In Lösungen kann
eine Sonde enzymatisch abgebaut werden durch
Verwendung einer einsträngigen spezifischen
Nuklease.