Hoefer HB1000 - Manual (Page 25)

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Reagenzien
• Deionisiertes, steriles Wasser
• EDTA, 0,5 M
• DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, 4-5 Einheiten/µL
• Nucleotide Mix (300 uM dATP, dCTP, dGTP und
60 uM dTTP)
• Zufallsbild Nonamer (9-mer) Primer, 2,5 µg/µL in
Wasser
• Reaktionspuffer, 10X (50 mM MgCl
2
, 10 mM
2-Mercaptoethanol, 500 mM Tris-HCl, pH 7,5)
• Tagged Nukleotid: Fluorescein-11-dUTP
• Template DNA in Wasser (5 ng/ml)
Verfahren
1. Je 10 µL der Template-DNA plus 10 µL Wasser
in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fest
verschließen. Sichere Kappe mit einer Kappe oder
einen Verschluss Büroklammer um sicherzustel-
len, dass die Kappe nicht öffnet, wenn der Inhalt
gekocht werden.
2. Legen Sie das Rohr in den kochenden Wasserbad
für 5 Minuten.
3. Unmittelbar platzieren Röhrchen auf Eis für 5
Minuten.
4. Zentrifuge für 15 Sekunden in Mikrozentrifuge.
5. Fügen Sie die Reagenzien unten in ein frisches
Röhrchen auf Eis sind in der folgenden Reihen-
folge:
a. 10 µL Nucleotide Mix
b. 5 µL Tagged Nukleotid
c. 5 µL Reaktionspuffer (10X)
d. 5 µL Zufallsprimern
e. 10 µL Boiled DNA
f. 14 µL Wasser
g. 1 µL DNA-Polymerase, Klenow-Fragment
6. Vorsichtig mischen und bei 37 °C für 1 Stunde.
7. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 2 µL EDTA.
8. Shop-Sonden bei -20 °C im Dunkeln.