Hoefer HB1000 - Manual (Page 23)

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2. Lunghezza della sonda
L’obiettivo è di aumentare l’efficienza di ibridazione
minimizzando sfondo. Più grande è la sonda, il più effi-
cientemente lega bersaglio. Il più piccolo della sonda,
però, un numero sempre maggiore di molecole sonda è
presente per unità di quantità (ng). Nella maggior parte
dei casi le sonde variare da 20-1000 bps.
3. Sale di concentrazione e temperatura
Ibridazione dell’acido nucleico richiede sia sale
(cationi monovalenti, quali Na
+ ), per contrastare gli
effetti di carica della scheletro di fosfato, e calore,
per fornire non denaturante energia cinetica che guida
il passo lento nucleazione. Poiché gli effetti di ogni
variabile influenza l’altro, conoscendo la termosta-
bilità dell’ibrido sonda-bersaglio è utile. Il tasso di
ibridazione varia direttamente con la concentrazione
di ioni di sodio tra 0,03 e 1,2 M. maggior parte dei
protocolli richiedono un ambiente compresa tra 0,5 e
1,1 M Na
+ .
Situazione Risposta
G+C = 45 – 55% Seguire il protocollo normale.
G+C < 45% Inferiore sale e temperatura.
G+C > 55% Sollevare sale e temperatura.
La prova di mismatching Inferiore sale e temperatura.
sonda bersaglio.
Target e la sonda sono
Ibridizzare in una formammide
degradati in un ambiente basata soluzione tampone.
acquoso.
Inaccettabile fondo elevato. Utilizzare meno sonda.
Ibridare in basso sale/tempera-
tura più alta.
Lavare con minore sale/tempera-
tura più alta.
Incubare con sale molto basso,
il cambiamento nucleasi
(soluzione).
Utilizzare una sonda più piccola
o una sonda differente.
Pulire sonda di contaminanti
prima dell’uso.
Pulire sonda di contaminanti
prima dell’uso.