Hoefer HB1000 - Manual (Page 25)

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Réactifs
• Déminéralisée, de l’eau stérile
• EDTA, 0,5 M
• ADN polymérase, fragment de Klenow, 4-5 unités/µL
• Mélange de nucléotides (300 uM de chacun de
dATP, dCTP, dGTP et 60 uM de dTTP)
• Nonamère aléatoire (9-mer) amorces, 2,5 pg/uL
dans l’eau
• Tampon de réaction, 10X (50 mM MgCl
2
, 10 mM
de 2-mercaptoéthanol, 500 mM Tris-HCl, pH 7,5)
• Tagged nucléotides: la fluorescéine-11-dUTP
• Modèle de l’ADN dans l’eau (5 ng/ml)
Procédure
1. Pipeter 10 µL d’ADN matrice majoré de 10 µL
d’eau dans un tube à centrifuger et fermer hermé-
tiquement. Bouchon sécurisé avec une serrure
du bouchon ou utilisez un trombone plié afin de
s’assurer que le bouchon ne saute pas lorsque le
contenu est bouilli.
2. Placer le tube dans le bain d’eau bouillante
pendant 5 minutes.
3. Immédiatement placer le tube sur la glace pendant
5 minutes.
4. Centrifuger pendant 15 secondes à centrifuger.
5. Ajouter les réactifs indiqués ci-dessous dans un
nouveau tube sur la glace dans l’ordre suivant:
a. 10 µL mélange de nucléotides
b. 5 µL Tagged nucléotide
c. Réaction tampon 5 µL (10X)
d. 5 µL amorces aléatoires
e. 10 µL d’ADN bouilli
f. 14 Eau µL
g. ADN polymerase 1 µL, fragment de Klenow
6. Mélanger doucement et incuber à 37 °C pendant
1 heure.
7. Arrêter la réaction en ajoutant 2 µL d’EDTA.
8. Sondes conserver à -20 °C dans l’obscurité.