Hoefer HB1000 - Manual (Page 26)

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Protocole
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L’hybridation à nylon ou de nitrocellulose
L’hybridation de la sonde à l’acide nucléique cible qui
a été précédemment transférés sur des membranes
de nylon ou de nitrocellulose est réalisé en ajoutant
la sonde simple brin aux membranes qui ont d’abord
été incubées avec une solution de pré-hybridation. À
la fois la préhybridation et d’hybridation des solutions
tampons contiennent destinés à empêcher la liaison
de la sonde accidentelle des filtres.
Réactifs et matériel
• Préhybridation/hybridation en solution [45% de
formamide, 5X SSPE (0,9 M de NaCl, 50 mM
de tampon phosphate de sodium, pH 7,4, EDTA
5 mM), 0,1% de SDS, la solution de 5X Denhardt
(0,1% chacun de Ficoll, la polyvinylpyrrolidone et
bovine albumine de sérum), et 100 mg/mL d’ADN
de sperme de saumon dénaturé]. Bien mélanger et
retirer les agrégats avant de l’utiliser.
• Bouteille hybridation Hoefer et bouchons
• 15 mL tube en plastique
• Bain d’eau bouillante
• Seau de glace
• Gants
• Beta blocage bouclier
• Hoefer HB1000 four d’hybridation
Remarque: Lors de la
préparation de préhybridation/
hybridation des solutions,
ajouter les réactifs secs
directement à la solution de
formamide/SSC. Incuber avec
un mélange à 40-50 °C pendant
2 heures ou jusqu’à dissolution.
Conserver à -20 °C. SDS va
précipiter à la température
ambiante, mais restent en
solution à 37 °C.