Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 18)

• Négatif
• Population faible, risque maîtrisé
• Population critique à surveiller
• Population très élevée, risque de production de Phénols volatils
Le VINEO™ Brettanomytest PCR Kit peut également être utilisé sur un
mode qualitatif pour la confirmation de colonies isolées à partir d’un milieu
de culture.
2 - PRINCIPE DU VINEO™ Brettanomytest PCR Kit
Ce test repose sur l’amplification, la détection et la quantification de
séquences d’ADN par la technique de PCR en temps réel. Il utilise des
amorces et une sonde d’ADN spécifiques de Brettanomyces bruxellensis.
La détection et l’analyse des résultats sont optimisées pour l’utilisation
avec un thermocycleur pour la PCR en temps réel Bio-Rad, tel que le
MiniOpticon™, le Chromo4™ ou le CFX96™.
Au cours de la réaction de PCR, les amorces vont s’hybrider à la région
cible puis, catalysées par la polymérase, s’allonger dans le sens 5’-3’ en
utilisant les désoxynucléotides triphosphates (dNTPs) présents dans le
mélange réactionnel, créant ainsi une séquence complémentaire d’ADN,
appelée amplicon.
Pendant la PCR, des sondes oligonucléotidiques, spécifiques de la
séquence cible, vont s’hybrider aux amplicons. Ces sondes, marquées
par des fluorophores, émettent de la fluorescence uniquement quand
l’hybridation a lieu. La sonde qui se lie à la séquence cible de
Brettanomyces bruxellensis est marquée par un fluorophore spécifique.
L’intensité de fluorescence augmente proportionnellement à
l’augmentation de la quantité des produits d’amplification dans le tube de
PCR. La fluorescence ainsi générée est mesurée directement par le
module optique du thermocycleur.
Un ADN synthétique appelé « Contrôle interne » est ajouté à chaque
réaction. Il est amplifié en même temps que les séquences cibles de
Brettanomyces bruxellensis, mais détecté par une sonde marquée avec
un deuxième fluorophore. Il permet de mettre en évidence un éventuel
phénomène d’inhibition de la réaction.
Le logiciel associé à l’appareil calcule automatiquement la relation entre
l’intensité de la fluorescence et le cycle d’amplification. Cette relation indique
la présence, ou l’absence, de Brettanomyces bruxellensis dans l’échantillon.
Les résultats obtenus pour l’amplification de ces ADN sont analysés par les
logiciels Opticon Monitor™ ou CFX Manager™ IDE software programmés
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