Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 46)

• Negativo
• Popolazione bassa, rischio controllato
• Popolazione critica, da tenere sotto controllo
• Popolazione molto elevata, rischio di produzione di Fenoli volatili
VINEO™ Brettanomytest PCR Kit può essere utilizzato anche in modalità
qualitativa per la conferma di colonie isolate a partire dal mezzo di coltura.
2 - PRINCIPIO DEL VINEO™ Brettanomytest PCR Kit
Questo test si basa sull'amplificazione, la rilevazione e la quantificazione di
sequenze di DNA mediante la tecnica di PCR in tempo reale. Utilizza dei primer
e una sonda da DNA specifici per Brettanomyces bruxellensis. La rilevazione e
l'analisi dei risultati sono ottimizzate per l'utilizzazione con un termociclatore per
la PCR in tempo reale Bio-Rad, quale il MiniOpticon™, il Chromo4™ o il
CFX96™.
Durante la reazione di PCR, i primer si ibrideranno alla regione bersaglio poi,
catalizzati mediante polimerasi, si allungheranno nelle direzioni 5’-3’ utilizzando i
desossinucleotidi trifosfati (dNTP) presenti nella miscela di reazione, creando in
questo modo una sequenza complementare di DNA, detta amplicon.
Durante la PCR, sonde oligonucleotidiche, specifiche della sequenza
bersaglio, si ibrideranno agli amplicon. Queste sonde, marcate con
fluorofori, emettono fluorescenza solo quando ha luogo l'ibridazione. La
sonda che si lega alla sequenza bersaglio di Brettanomyces bruxellensis è
marcata con un fluoroforo specifico. L'intensità di fluorescenza aumenta
proporzionalmente all'aumento della quantità dei prodotti di amplificazione
nella provetta di PCR. La fluorescenza così generata viene misurata
direttamente attraverso il modulo ottico del termociclatore.
Ad ogni reazione viene aggiunto un DNA sintetico chiamato “Controllo
interno”. Viene amplificato simultaneamente alle sequenze bersaglio di
Brettanomyces bruxellensis, ma rilevato mediante una sonda marcata con
un secondo fluoroforo. Consente di evidenziare un eventuale fenomeno di
inibizione della reazione.
Il software associato all'apparecchio calcola automaticamente la relazione tra
l'intensità della fluorescenza e il ciclo di amplificazione. Questa relazione indica
la presenza, o l'assenza, di Brettanomyces bruxellensis nel campione.
I risultati ottenuti per l'amplificazione di questi DNA sono analizzati dal
software Opticon Monitor™ oppure CFX Manager™ programmati per
eseguire un'analisi automatica e quantitativa. Viene allora proposta
all'utilizzatore un'interpretazione relativa al rischio correlato alla presenza di
Brettanomyces bruxellensis.
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