Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 52)

Interpretazione dei risultati ottenuti sui campioni:
**: In caso di valore nullo per un campione e il suo controllo interno (Ct = N/A), l'analisi deve essere
ripetuta con il campione di DNA diluito ( a 1/5° o a 1/10° per esempio).
***: Può capitare di ottenere un valore inferiore a 10, verificare che la curva come dato grezzo abbia un
aspetto caratteristico di amplificazione esponenziale (linea di base piatta, poi aumento regolare della
fluorescenza seguito da un plateau). Se la curva osservata è corretta, il campione può essere
considerato positivo per la presenza di Brettanomyces bruxellensis. in caso contrario, l'interpretazione
del risultato dipende dal valore del controllo interno, come spiegato nei paragrafi precedenti.
12 - PROTOCOLLO DI CONFERMA A PARTIRE DA COLONIE ISOLATE
È possibile utilizzare il test VINEO™ Brettanomytest PCR Kit per la conferma
di colonie isolate su agar-agar.
1. Pungere una colonia isolata, a partire da un mezzo selettivo o non, con
uno stuzzicadenti o un'ansa da 1 μl, o qualsiasi altro materiale corrente di
laboratorio adatto (cono di pipettaggio per esempio).
2. Risospendere la colonia in 100 μl di R2 in una provetta Eppendorf (è
possibile risospendere la colonia in soluzione di acqua fisiologica sterile,
l'efficienza della PCR può quindi essere influenzato). Omogeneizzare bene
la sospensione utilizzando il vortex.
3. Porre 5 μl della sospensione in 45 μl della miscela di reazione PCR (Cf.
parte 9.2 PCR in tempo reale) e seguire il resto del metodo VINEO™
Brettanomytest PCR Kit per ottenere e interpretare i risultati.
Nota: una sola analisi qualitativa viene realizzata a partire dalla PCR
effettuata su questa sospensione. Il segnale ottenuto in PCR è
spesso molto elevato poiché la quantità di cellule prelevate e
analizzate mediante PCR con questo metodo è molto considerevole.
13 - PRESTAZIONI DEL TEST E VALIDAZIONI
Il test VINEO™ Brettanomytest PCR Kit è specifico per la rilevazione di
Brettanomyces bruxellensis. È possibile rilevare il lievito a partire da:
• 500 UFC/ml di vino con il protocollo di estrazione del DNA descritto nel
VINEO™ Extract DNA Kit: su 1,8 ml per un mosto in fermentazione o
un vino carico in corso di vinificazione o di affinamento e
• 10 UFC/ml di vino secondo il protocollo che parte da 45 ml per un vino
poco carico, prossimo all'imbottigliamento o già imbottigliato la cui
analisi richiede un livello di sensibilità analitica elevato.
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© 2010 Bio-Rad
Rilevazione di Brettanomyces
bruxellensis (FAM)
Rilevazione del controllo
interno
Interpretazione
Ct ≥ 10*** Non significativo Positivo
Ct = N/A Ct
HEX
≥ 28 Negativo
Ct = N/A Ct = N/A Inibizione**