Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 24)

Interprétation des résultats obtenus sur les échantillons :
** : En cas de valeur nulle pour un échantillon et son contrôle interne (Ct = N/A), l’analyse doit être
renouvelée avec l’échantillon d’ADN dilué (au 1/5
e ou au 1/10 e par exemple).
*** : Il peut arriver qu’une valeur inférieure à 10 soit obtenue, vérifier que la courbe en tant que donnée
brute montre un aspect caractéristique d’amplification exponentielle (ligne de base plate, puis
augmentation régulière de la fluorescence, suivi par un plateau). Si la courbe observée est correcte, on
peut considérer l’échantillon positif pour la présence de Brettanomyces bruxellensis. Dans le cas
contraire, l’interprétation du résultat dépend de la valeur du contrôle interne, comme il est expliqué
dans les paragraphes ci-dessus.
12 - PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIES ISOLÉES
Il est possible d’utiliser le test VINEO™ Brettanomytest PCR Kit pour la
confirmation de colonies isolées sur gélose.
1. Piquer une colonie isolée, à partir d’un milieu sélectif ou non, à l’aide d’un
cure-dent ou d’une œse de 1 μl, ou autre consommable adapté (cône
pipette par exemple).
2. Resuspendre la colonie dans 100 μl de R2 dans un tube de type Eppendorf
(il est possible de resuspendre la colonie dans de l'eau physiologique stérile,
l'efficacité PCR peut alors être affectée). Bien homogénéiser la suspension à
l’aide d’un vortex.
3. Déposer 5 μl de la suspension dans 45 μl du mélange réactionnel PCR (Cf.
partie 9.2 PCR en temps réel) et suivre le reste de la méthode VINEO™
Brettanomytest PCR Kit pour l’obtention et l’interprétation des résultats.
Note : seule une analyse qualitative est réalisée à partir de la PCR
effectuée sur cette suspension. Le signal obtenu en PCR est souvent
très élevé car la quantité de cellules prélevées et analysées par PCR
avec cette méthode est très importante.
13 - PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONS
Le test VINEO™ Brettanomytest PCR Kit est spécifique pour la détection de
Brettanomyces bruxellensis. Il est possible de détecter la levure à partir de :
• 500 CFU/mL de vin avec le protocole d’extraction d’ADN décrit dans le
VINEO™ Extract DNA Kit : sur 1,8 mL pour un moût en fermentation
ou un vin chargé en cours de vinification ou d’élevage et
• 10 CFU/mL de vin selon le protocole partant de 45 mL pour un vin peu
chargé, proche de l’embouteillage ou déjà mis en bouteille dont
l’analyse nécessite un niveau de sensibilité analytique élevé.
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© 2010 Bio-Rad
Détection de Brettanomyces
bruxellensis (FAM)
Détection du contrôle interne Interprétation
Ct ≥ 10*** Non significatif Positif
Ct = N/A Ct
HEX
≥ 28 Négatif
Ct = N/A Ct = N/A Inhibition**