Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 38)

- Si el Ct
HEX
del control interno es inferior a 28, no es posible interpretar el
resultado. Comprobar que se haya colocado el umbral correctamente o
que la curva bruta muestre un aspecto característico de amplificación
exponencial. Si la curva observada no es correcta, será necesario
repetir la prueba de PCR para esa muestra.
Interpretación de los resultados obtenidos con las muestras:
**: En caso de valor nulo en una muestra y su control interno (Ct = N/A), el análisis debe repetirse con
la muestra de ADN diluida (por ejemplo, en relación 1:4 o 1:9).
***: Puede ocurrir que se obtenga un valor inferior a 10. En ese caso, hay que comprobar que la curva
de datos brutos muestre un aspecto característico de amplificación exponencial (línea de base plana
seguida de aumento regular de la fluorescencia hasta llegar a una meseta). Si la curva observada es
correcta, puede considerarse que la muestra es positiva en Brettanomyces bruxellensis. En caso
contrario, la interpretación del resultado depende del valor del control interno, según lo explicado en los
párrafos anteriores.
12 - PROTOCOLO DE CONFIRMACIÓN A PARTIR DE COLONIAS
AISLADAS
Es posible utilizar la prueba VINEO™ Brettanomytest PCR Kit para confirmar
colonias aisladas en agar.
1. Pinchar la colonia aislada, ya sea a partir de un medio selectivo o no, con
ayuda de un palillo, un asa de siembra de 1 μL u otro consumible
adecuado (p. ej. un cono de pipeta).
2. Volver a suspender la colonia en 100 μl de R2 en un tubo Eppendorf (es
posible para volver a suspender la colonia en agua fisiológica estéril, la
eficiencia de PCR pueden ser afectadas). Homogeneizar bien la
suspensión en un vórtex.
3. Poner 5 μL de la suspensión en 45 μL de la mezcla reactiva de la PCR
(véase apartado 9.2 PCR en tiempo real) y seguir el resto del método del kit
VINEO™ Brettanomytest PCR Kit para obtener e interpretar los resultados.
Nota: Sólo se realiza un análisis cualitativo a partir de la PCR efectuada
con esta suspensión. A menudo, la señal obtenida con la PCR es muy
elevada debido a que la cantidad de células extraídas y analizadas
mediante PCR con este método es muy grande.
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© 2010 Bio-Rad
Detección de Brettanomyces
bruxellensis (FAM)
Detección del control interno
Interpretación
Ct ≥ 10*** No significativo Positivo
Ct = N/A Ct
HEX
≥ 28 Negativo
Ct = N/A Ct = N/A Inhibición**