Bio-Rad VINEO™ Brettanomytest PCR Kit - Manual (Page 32)

• Negativo
• Población pequeña, riesgo controlado
• Población crítica que debe vigilarse
• Población muy elevada, riesgo de producción de fenoles volátiles
El kit VINEO™ Brettanomytest PCR Kit puede usarse asimismo de modo
cualitativo para confirmar colonias aisladas a partir de un medio de cultivo.
2 - PRINCIPIO DEL Kit VINEO™ Brettanomytest PCR Kit
Esta prueba se basa en la amplificación, detección y cuantificación de
secuencias de ADN mediante la técnica de PCR en tiempo real. Utiliza
cebadores y una sonda de ADN específicos de la Brettanomyces
bruxellensis. La detección y el análisis de los resultados se optimizan para
el uso con un termociclador para PCR en tiempo real de Bio-Rad, como
el MiniOpticon™, el Chromo4™ o el CFX96™.
Durante la reacción de la PCR, los cebadores se hibridan en la región
objetivo y después, catalizados por la polimerasa, se extienden en sentido
5’-3’ utilizando los desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) presentes en la
mezcla reactiva, creando de este modo una secuencia complementaria
de ADN llamada «amplicón».
Durante la PCR, se hibridan con los amplicones sondas oligonucleotídicas
específicas de la secuencia objetivo. Dichas sondas, marcadas mediante
fluoróforos, sólo emiten fluorescencia cuando se produce la hibridación.
La sonda que se une a la secuencia objetivo de Brettanomyces
bruxellensis se marca con un fluoróforo específico. La intensidad de la
fluorescencia aumenta en proporción a la cantidad de productos de
amplificación en el tubo de PCR. El módulo óptico del termociclador mide
directamente la fluorescencia generada de este modo.
A cada reacción se añade un ADN sintético llamado «control interno» que se
amplifica a la vez que las secuencias objetivo de Brettanomyces bruxellensis pero
es detectado por una sonda marcada con un segundo fluoróforo. Este control
interno permite evidenciar un posible fenómeno de inhibición de la reacción.
El software asociado al aparato calcula automáticamente la relación entre la
intensidad de la fluorescencia y el ciclo de amplificación. Esta relación indica la
presencia o ausencia de Brettanomyces bruxellensis en la muestra.
Los resultados obtenidos mediante amplificación de este DNA son analizados
por los softwares Opticon Monitor™ o CFX Manager™ IDE que han sido
programados para realizar análisis cuantitativos y automáticos. Entonces se
ofrece al usuario una interpretación del riesgo relacionado con la presencia de
Brettanomyces bruxellensis.
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